潮霉素B液體和干粉原來(lái)是這樣操作！

潮霉素B（Hygromycin B）是由吸水鏈霉菌（Streptomyces hygroscopicus）代謝產(chǎn)生的一種氨基糖苷類(lèi)抗生素，通過(guò)干擾70S核糖體易位和誘導(dǎo)對(duì)mRNA模板的錯(cuò)讀而抑制蛋白合成，從而殺死原核（如細(xì)菌）、真核（如酵母菌，真菌）和高等哺乳動(dòng)物真核細(xì)胞。

液體：無(wú)菌的潮霉素B溶液（100mg/ml），可直接用培養(yǎng)液稀釋使用。

干粉：本品是潮霉素B干粉，用于細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)溶解后過(guò)濾除菌。溶劑水，PBS溶液。

常用篩選濃度

注意：潮霉素B用來(lái)篩選穩(wěn)轉(zhuǎn)株的工作濃度需要根據(jù)細(xì)胞類(lèi)型，培養(yǎng)基，生長(zhǎng)條件和細(xì)胞代謝率而變化，使用濃度為50-1000μg/mL。對(duì)于次使用的實(shí)驗(yàn)體系建議通過(guò)建立殺滅曲線(xiàn)（kill curve），即劑量反應(yīng)性曲線(xiàn)，來(lái)確定*篩選濃度。

一般而言，哺乳動(dòng)物細(xì)胞50-500μg/mL；細(xì)菌/植物細(xì)胞20-200μg/mL；真菌300-1000μg/mL。

穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞的篩選

1）     轉(zhuǎn)染48h后，用含有適當(dāng)濃度的潮霉素B篩選培養(yǎng)基來(lái)傳代細(xì)胞（直接傳代或者稀釋后傳代）。

注意：細(xì)胞處于活躍分裂狀態(tài)時(shí)抗生素的殺傷效果。則當(dāng)細(xì)胞過(guò)于稠密，其效率會(huì)降低。為了得到較好的篩選效果，將細(xì)胞稀釋至豐度不超過(guò)25%。

2） 每隔3-4天更換含有藥物的篩選培養(yǎng)液。

3）  篩選7天后觀察并評(píng)估細(xì)胞克隆（集落）的形成情況。集落的形成可能還需要一周或者更多的時(shí)間，這取決于宿主細(xì)胞類(lèi)型，轉(zhuǎn)染，以及篩選效果。

4） 挑取并轉(zhuǎn)移5-10個(gè)抗性克隆于35mm細(xì)胞培養(yǎng)板，繼續(xù)用含藥物的篩選培養(yǎng)液維持培養(yǎng)7天。

5） 之后更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)即可。

注意事項(xiàng)

1） 潮霉素B的抗性基因（hyg或hph）除了來(lái)自E. Coli.之外，還發(fā)現(xiàn)于其他的菌株，包括Streptomyces hygroscopicus和Klebsiella pneumoniae。

2） 本品為有毒化合物，避免與皮膚和眼睛接觸，請(qǐng)小心操作。

3） 為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。